Anatómiával való ismerkedése már firenzei művészeti tanulmányai alatt elkezdődött. Verrocchio mester iskolájában természetesen már tanulmányozta az emberi test művészeti anatómiáját, azonban később olyan mélyre ásott a témában, amennyire előtte talán egyetlen művész, de még orvos sem. A jól ismert Vitruvius-tanulmányon túl – mely az emberi test arányait, geometriai összefüggéseit vizsgálta az aranymetszés szabályai alapján – Leonardo fontosnak tartotta a bőr alá is betekinteni. A holttestek boncolása addigra már kezdett kitörni a tabu kategóriájából, Leonardo pedig szisztematikus munkával rendkívüli alaposságú illusztrációkat készített az emberi szervezetről, melyek a kor anatómiaoktatásában etalonnak számító Galenus egyes tévedéseit is leleplezték. Anatómiai munkáit kimondottan modernnek és innovatívnak nevezhetjük, egyrészt a tájanatómiai, funkcionális és összehasonlító szemléletmódja, másrészt új boncolási és ábrázolási technikák kidolgozása miatt. Ennek értelmében egyrészt hangsúlyozta a szervek egymáshoz való térbeli viszonyának fontosságát, valamint az anatómia és a működés összefüggéseit. Felismeri például, hogy a gerincvelő szükséges a vázizmok mozgatásához; úgy fogalmaz, hogy a gerincvelő lehet tehát „a mozgás és az élet forrása”. Ugyanakkor állatokat is boncolt az emberi szervezettel való összehasonlítás céljából, ugyanis felismerte a különböző szervezetek közötti analógiákat, amit ábráin úgy mutatott be, hogy az emberi csontvázat a lóéval való öszehasonlítás érdekében lábujjhegyen állva rajzolta. Az izmok rajzolásának gyakorlásához pedig a békalábat ajánlja, ami hasonlít az emberi lábhoz. Az anatómia alapos ismerete nyilvánvaló szerepet játszik a festészetben, ugyanakkor a testfelépítésen túl fontos figyelmet fordított a test mozgására is. Megfigyelte, hogy különböző testtartásokban, pozíciókban hová helyeződik a test tömegközéppontja, ami lehetővé tette a mozgásban lévő testről készült hiteles „pillanatfelvételek” készítését, így a szemlélő számára szinte megmozdulnak festményein a szereplők.
Érdeklődését azonban nem kizárólag az élővilág jelenségei kötötték le; a fennmaradt kéziratok szerint legalább ennyit foglalkozott a mechanika és a hidraulika kérdéseivel, valamint ezek műszaki alkalmazásával. Tudománya ugyanis alkalmazott és célvezérelt jellegű: egyrészt a festészetben kamatoztatja, másrészt olyan célok vezetik, mint a repülés. A repülés visszatérő témája Leonardo műszaki rajzainak. Többféle, különböző elven működő repülő szerkezetet tervezett, azonban egyik sem bizonyult alkalmasnak az égbolt meghódítására. Az elmés szerkezetek és korát megszégyenítő mérnöki megoldások ellenére ugyanis alulbecsülte azt az erőt, ami szükséges a gravitáció legyőzéséhez. Leonardo gépei elsősorban az emberi erőre alapoztak, ami kevésnek bizonyult. Tudni kell, hogy amikor Leonardo 1482-től Ludovico Sforza milánói herceg szolgálatába állt, „motivációs levelében” alapos mérnöki ismereteiről biztosította a herceget, ami hasznára lehet különféle hadi és egyéb gépek építésében, öntvények készítésében. Egyébként –jegyezte meg –, festeni is tud. A Sforza-udvarban töltött szolgálata során fő megbízatása egy bronzszobor elkészítése volt a herceg apjának, Francesco Sforzának az emlékére. A koncepció hosszú evolúción ment át: az eredetileg életnagyságú, lovas szoborcsoport tervéből monumentális, ágaskodó ló lett, ami da Vinci számára izgalmas kihívás és fontos téma egész művészetében. A hatalmas méret és súly miatt azonban stabilabb pozíciót választott: a lépdelő lovat. A bronzlovat egyben kiönteni komoly mérnöki tervezést igényelt. Leonardo alaposan kidolgozta az öntés technikáját, megtervezte az öntőcsarnokot és a hatalmas öntőformát, valamint annak mozgatásához szükséges emelőgépeket. Egy agyagmodellje is elkészült a szobornak, de közbeszólt a franciák támadása: a lóhoz összegyűjtött bronzból ágyúk készültek, az agyagmodell pedig a Milánót megszálló francia katonák céltáblájaként végezte. A tizenhét évig tartó munkának a sorsát pedig a Sforza család bukása pecsételi meg. Ötszáz évvel később azonban egy amerikai műkedvelőnek köszönhetően elkészült a több mint hét méter magas bronzszobor Leonardo tervei alapján, ami Milánó San Siro városrészében került felállításra.
Leonardo egyébként számos műszaki újítását, elgondolását is az élővilágból vezette le, azt az elvet alkalmazva, hogy a természetben megtalálható minták modelljei a tervezésnek. Másrészt a geometria megszállottjaként nagyon érdekelték az olyan alakzatok, mint például az elágazó formák (fák, folyók), az egybefonódó (haj) és egymásba illeszkedő formák (kéz ujjai, fogak). Utóbbiakat alkalmazta gépeinek alapvető alkatrészein, mint például csapágyakban, fogaskerekekben. A műszaki tervezésben különös érdeklődést mutatott a programozható szerkezetek iránt. Utóbbiak közé tartoznak tervei egy programozható ívet befutó, rugós elven működő „autóról”, valamint élete utolsó szakaszában a francia király udvari mulatságaira tervezett önjáró oroszlánbábu. A geometrián belül komolyan foglalkoztatta az alakzatok egymásba transzformálhatósága is, sőt hitte, hogy az élő szervezetek is „áttranszformálhatók” egymásba. Az anghiari csata című freskóján – Rubens másolata szerint – megjelenik ez az elv egy kiméra képében, ugyanis az egyik, bestiális jegyeket hordozó harcos a művészi eszközök segítségével szinte egybeolvad lovával.